senescencia celular – Fuente de la Eterna Juventud

The Walking Dead Celular 2

En todas las circunstancias de la vida nos encontramos parejas con actividades similares, pero distinta fortuna o reconocimiento de su actividad: Edison y Tesla, Lord Byron y Polidori, Mozart y Salieri, Shakespeare y Marlowe, los Hermanos Calatrava, …

De manera similar, el proceso de muerte celular programada (o apoptosis) es un mecanismo de éxito instantáneo que goza de gran popularidad y reconocimiento desde su descripción; mientras que el proceso hermano, el de senescencia celular, arrastra una larga y penosa existencia, siempre a la sombra de la apoptosis.

Es muy probable que el lector (los hay así de frikis) haya oído en algún momento hablar de la apoptosis descrita como el suicidio que cometen las células de manera genéticamente controlada, obedeciendo señales que les llegan desde el exterior o generadas internamente, y que cumple importantes funciones en el organismo. Una excelente divulgadora como Esther “Shora” Samper escribió hace algún tiempo sobre este proceso en alguna entrada de su sensacional MedTempus.

Desde su identificación, la labor de multitud de laboratorios en todo el mundo ha llevado a un conocimiento cada vez más detallado de todos los mecanismos que operan en esta respuesta. La disponibilidad de buenos marcadores y ensayos que permiten identificar y medir el proceso ha sido sin duda determinante en su popularidad. Y es que hay que tener presente que existe, por supuesto, un importante sesgo en nuestro conocimiento derivado del hecho de que aquello que es susceptible de ser estudiado de una manera sencilla y precisa recibe mayor atención que aquellos otros procesos para los que desconocemos herramientas básicas que nos faciliten su estudio (fin de la disgresión).

Para los que hayan leído la entrada “hermana” a esta en la que hablamos de la senescencia celular, está claro que la senescencia es la pariente pobre, la pareja en la sombra, el hermano Calatrava feo, de la apoptosis. Ya en su descripción hace ahora poco más de medio siglo por Len Hayflick, la imposibilidad de volver a iniciar la división celular que caracteriza a la senescencia se atribuyó a la torpeza de los investigadores y su impericia con los sistemas de cultivo celular. Cuando el proceso de apoptosis fue descrito inicialmente por Kerr, Currie y Wyllie en 1972, muchos pensaron de nuevo que la muerte de las células en cultivo era consecuencia de la incompetencia de los investigadores en su mantenimiento. Sin embargo, pronto otros laboratorios consiguieron identificar los mismos cambios, las mismas características, en sus propios cultivos.

Los estudios sobre la apoptosis llevaron al Premio Nobel de Medicina y Fisiología en 2002 a los investigadores Sydney Brenner, John Sulston y Robert Horvitz, por sus trabajos con el gusano Caenorhabditis elegans, que sirvió para identificar por primera vez los genes que controlan este proceso, genes conservados también en organismos superiores, incluidos los humanos. Se trata por tanto de un proceso que cuenta con su maquinaria propia inscrita en el genoma y conservada a lo largo de la evolución.

Pero sin duda, describir una funcionalidad clara al proceso de apoptosis fue clave para su reconocimiento. La apoptosis demostró pronto ser un mecanismo útil para deshacerse de células que podrían suponer un peligro para el organismo por hallarse dañadas. Multitud de perrerías que los investigadores hacen sobre las células en cultivo disparan las señales que conducen inexorablemente al suicidio celular. De hecho, los tumores llegan a ser lo que son porque escapan al control de la apoptosis y se asume que conseguir reactivar este mecanismo en las células tumorales es el objetivo deseable de toda terapia antitumoral. El propio envejecimiento celular por acortamiento de los telómeros (las estructuras en los extremos de los cromosomas que los protegen) pone en marcha la maquinaria que acaba con la vida de la célula sin dejar huella y con ello nuestros tejidos pierden propiedades. El sistema inmune hace limpieza masiva con este proceso y defectos en la maquinaria de apoptosis tienen consecuencias funestas en forma de enfermedades autoinmunes.

Y como guinda del pastel, la apoptosis participa en el desarrollo embrionario como mecanismo capaz de moldear distintas estructuras. Un ejemplo muy gráfico es el de la desaparición de las membranas interdigitales tras la muerte masiva de las células que forman esas uniones entre los incipientes dedos del embrión. O el clásico ejemplo del renacuajo que madura y pierde la cola. En todos ellos, la apoptosis es un mecanismo empleado por el organismo para deshacerse de las células que deben desaparecer de una determinada estructura en un momento preciso del desarrollo.

células “suicidas” versus células “zombies”

Pero el asunto de esta entrada era la senescencia celular y, de nuevo, la apoptosis intenta restarle protagonismo. Como indicamos en la entrada anterior a esta, la senescencia celular ha demostrado ser una respuesta que se establece en la célula cuando existe una situación de potencial peligro, es un eficiente mecanismo de control antitumoral y, probablemente, predomina durante el envejecimiento como resultado del agotamiento de la capacidad de división celular. Lo que le faltaba a la senescencia celular era demostrar su implicación también en el desarrollo embrionario.

Por eso hace ya años Manuel Serrano, con una mente siempre inquieta e imaginativa, se lanzó a investigar esta posibilidad. El desarrollo embrionario es un complejísimo proceso de fuerzas que dirigen la división, migración y diferenciación coordinada de multitud de células distintas en periodos de tiempo extraordinariamente cortos (si comparamos con el resto del periodo de vida de un organismo adulto). Podríamos decir que buscar células que estuviesen en ese estado de senescencia celular sería como buscar una aguja en un pajar. Sin embargo, se contaba con alguna pista en el laboratorio y por eso, Daniel Muñoz, investigador del grupo que dirige Manolo Serrano, orientó su mirada hacia una peculiar estructura, el mesonefros.

El mesonefros es un órgano excretor de vertebrados que sirve como riñón primitivo y que actúa de manera temporal durante el desarrollo. En peces y anfibios permanece en parte dando lugar al riñón adulto, pero en reptiles, aves y mamíferos se atrofia y desaparece casi en su totalidad, salvo algunas pequeñas partes que se “reciclan” para contribuir en la formación de estructuras de órganos genitales (sí, somos así de aprovechados).

Ese proceso de degeneración tiene lugar en un instante muy concreto del desarrollo, así que Dani se hizo con embriones de ratón de días consecutivos, abarcando momentos antes, durante y después de los correspondientes con el periodo esperado de desaparición del mesonefros. Cuando se analizaron esos embriones lo primero que llamó la atención fue que se podían detectar estructuras que estaban formadas por células que presentaban marcadores de senescencia, pero no correspondían con el mesonefros; o al menos no únicamente con el mesonefros.

En un lateral de la cabeza del embrión aparecía una estructura con forma de canal que claramente se teñía positiva con la reacción que detecta células senescentes. Esa estructura (tras mucho consultar y estudiar) resultó ser el saco endolinfático, parte del oído y encargado del drenaje de la endolinfa, el líquido del oído interno con una función esencial en el equilibrio.

Yendo más en detalle a la zona en donde se encuentra el mesonefros se pudieron identificar, como se esperaba, células senescentes formando parte de los túbulos mesonéfricos que, de acuerdo al estadio de desarrollo, se encontraban en regresión.

Esquemas que representan la estructura del mesonefros (arriba) y del saco endolinfático (abajo) (ilustraciones de Dani Muñoz)

En ambas estructuras, el saco endolinfático y el mesonefros, se podían observar células senescentes únicamente en un breve periodo de tiempo que se corresponde con un recambio de las células que forman parte de la estructura, en el caso del saco endolinfático, y con la atrofia de los túbulos, en el caso del mesonefros.

Existen otras zonas del embrión que también resultan positivas en la reacción de detección de células senescentes y de hecho otro grupo, dirigido por Bill Keyes en el CRG de Barcelona, observó de manera independiente este hecho y caracterizó más en detalle alguna otra área del embrión. Por ejemplo, centró su atención en la cresta ectodérmica apical, una fina línea celular que se encuentra en el ápice del esbozo de las extremidades en desarrollo.

El grupo de Manolo Serrano identificó una molécula que parece ser responsable de imponer este estado de senescencia celular tanto en el oído como en el mesonefros. Se trata de la proteína p21, producto del gen Cdkn1a y que ya había sido implicado en otras situaciones que derivan en senescencia celular. En el laboratorio se tienen ratones modificados genéticamente en los que el gen Cdkn1a ha sido eliminado, así que Dani repitió sus análisis en embriones que carecen de p21. El resultado es que ambas estructuras, saco y mesonefros, no muestran la inducción de senescencia que sí es visible en animales normales.

Lógicamente, en una situación así, cualquier investigador espera poder observar un defecto funcional derivado de la falta de la molécula que lleva a cabo el proceso. Así que gracias a la colaboración de expertos del IIB (CSIC-UAM) y de la UCM de Madrid se analizó la audición y el equilibrio de animales que carecen de p21, tanto jóvenes como adultos. Pero los animales no muestran ninguna anomalía. Cuando se analizó qué ocurre en el caso del mesonefros la situación fue algo similar, aunque en este caso sí se pudieron observar unos pequeños defectos en los órganos sexuales femeninos que parecen estar causados por la falta de senescencia durante el desarrollo de los animales que carecen de p21.

Quizás resulte sorprendente y hasta decepcionante para muchos. No faltarán fans de la apoptosis que ufanos proclamarán la superioridad del suicidio celular. Pero hay que tener en cuenta que el desarrollo embrionario es probablemente el periodo más finamente controlado en la vida de un organismo, puesto que cualquier mínimo detalle que escapase al control férreo que se ejerce en el embrión tendría unas consecuencias fatales que perdurarían en el adulto. De hecho, si se suprimen mediadores de apoptosis en modelos animales, tampoco el fallo en los procesos controlados por suicidio celular resulta en ningún defecto grave, y solo alterando gran número de vías podemos llegar realmente a poner de manifiesto la relevancia de ese control.

En el caso de los embriones con defecto en senescencia celular por falta del mediador p21, lo que Dani pudo observar es que esas estructuras se apañan para terminar cumpliendo con el plan previsto empleando un mecanismo de reserva, la apoptosis.

Esto que con torpeza he intentado explicar aquí, supondrá a partir de la publicación de este artículo del grupo de Manolo Serrano un nuevo capítulo a añadir a los libros de texto de biología, uno más de los que este investigador nos desvela gracias a su trabajo.

Artículo original:

Muñoz-Espı́n et al., Programmed Cell Senescence during Mammalian Embryonic Development. Cell (2013). http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2013.10.019

Daniel Muñoz-Espín, primer autor del artículo en Cell, recomienda Naukas#3

NOTA: Esta entrada apareció originalmente en el blog Naukas (naukas.com)

The Walking Dead Celular

Célula "zombie" senescente — Célula «zombie» senescente

La posibilidad de adaptar y mantener en crecimiento en placas de laboratorio células vivas obtenidas a partir de tejidos animales o de humanos supuso un enorme avance para el estudio de la biología y la medicina. Pese a las evidentes limitaciones que tiene obtener conocimiento sobre el funcionamiento de un organismo complejo a través del estudio detallado de sus componentes más simples, las células, el desarrollo de la tecnología de cultivo celular ha permitido atisbar los secretos del funcionamiento de la vida, además de habernos aportado una herramienta muy útil para el desarrollo biotecnológico.

Hace ahora medio siglo que uno de los pioneros del cultivo celular, Leonard “Len” Hayflick, realizó un estudio minucioso sobre las características y propiedades de las células humanas en cultivo. Sus precisas anotaciones reflejaban que las células humanas se adaptaban correctamente a las placas de plástico de laboratorio y los medios nutritivos en los que Hayflick cultivaba las células permitían su robusta y continua división. Sin embargo, invariablemente, los cultivos de células humanas de Hayflick derivaban con el tiempo (con las divisiones celulares en realidad) en unos cultivos de células que cambiaban de aspecto y frenaban su proliferación hasta detenerse por completo. Las placas que acogían células que llevaban un número elevado de divisiones celulares (y siempre rondaba aproximadamente el mismo número) se llenaban de células más grandes, con depósitos internos y que eran incapaces de volver a dividirse para dar lugar a células hijas. Las células estaban vivas, eran metabólicamente activas, pero eran incapaces de volver a dividirse. Podríamos decir que eran auténticas células zombies.

Leonard “Len” Hayflick, pionero del cultivo celular y el primero en definir el proceso de senescencia celular. Para él, la senescencia era la base celular del envejecimiento.

La difusión de esa observación a través del cauce habitual, la publicación de los resultados en revistas especializadas bajo revisión anónima por otros científicos especializados en el mismo área, le resultó muy difícil a Hayflick. Un eminente científico, el premio Nobel Peyton Rous, actuando como editor de la revista Journal of Experimental Medicine a la que Hayflick había enviado sus conclusiones contestó de manera destemplada prácticamente que lo que ocurría era que Hayflick no tenía ni idea de cómo cultivar células y por eso sus cultivos cesaban de dividirse.

Hay que ponerse en contexto, puesto que el dogma en aquel momento era que, efectivamente, las células en cultivo eran inmortales. A dicha conclusión se había llegado tras los estudios que se habían realizado utilizando células derivadas de tumores humanos durante la primera mitad del siglo pasado. E incluso a partir de datos ampliamente difundidos a principios de siglo por un investigador de enorme prestigio y de polémica personalidad y profesionalidad, el premio Nobel francés Alexis Carrel, quien había asegurado ser capaz de mantener durante más de 20 años cultivos de células procedentes de embriones de pollo establecidos en 1912. Aquellos cultivos en realidad se mantenían gracias a la adición de medios de crecimiento que procedían también de extractos de embriones de pollo y en los que nuevas células frescas encontraban su camino hacia el cultivo establecido, por error … o no.

Alexis Carrel, cirujano y premio Nobel, insistía en la importancia de mantener unas estrictas condiciones asépticas para el cultivo de células, y en cubrir absolutamente todo de negro (?!).

En cualquier caso, en la mente de todos los científicos que trabajaban con células a mediados del siglo pasado, los organismos eran mortales, pero las piezas básicas que los forman eran esencialmente inmortales, siempre y cuando se les cuidase y aportasen los medios nutritivos correctos. Las observaciones de Hayflick contradecían esta idea y el investigador postulaba que en realidad sus resultados constituían un reflejo del proceso de envejecimiento mostrado por las células en cultivo, y por ello a este fenómeno lo denominó “senescencia celular”.

En realidad hoy sabemos que, como casi siempre, algo de razón había en ambos bandos. Las células que cultivaba Hayflick eran “primarias”, que es como se denomina a las células que se ponen en cultivo directamente desde un tejido sano, sin haber sufrido ninguna modificación en su genoma. Las células inmortales cuyo crecimiento desaforado en cultivo observaban el resto de investigadores procedían de tumores y, por tanto, habían sufrido durante el proceso de conversión en célula tumoral todo tipo de aberraciones genéticas. Entre estas alteraciones que toda célula tumoral que se precie debe portar, se encuentran aquellas que impiden este proceso de senescencia celular, puesto que si algo caracteriza universalmente a las células tumorales es precisamente su capacidad indefinida de proliferación. Que este proceso que impide la división celular ilimitada en cultivo sea un reflejo del envejecimiento a nivel celular es algo que incluso hoy en día no está del todo claro, aunque muchos lo den por sentado.

Tumores experimentales en pulmón de ratón mostrando tinción de células senescentes. La tinción es positiva (azul) en los tumores benignos y negativa en los malignos.

Que la respuesta de senescencia celular constituye una barrera frente al crecimiento tumoral fue propuesto inicialmente en 1997 por un científico español referente mundial, el investigador del CNIO Manuel Serrano. Lo que Manolo propuso en aquel momento es que las células responden ante situaciones potencialmente peligrosas para su integridad genómica mediante senescencia celular como método seguro de impedir que los errores que pudieran generarse por la situación a la que las células se estén enfrentando se perpetúen y expandan. Impedir la división, entrando en ese estado zombi, asegura que la cosa no vaya a más.

Las visiones críticas con esta propuesta, que surgieron, se apaciguaron cuando varios laboratorios, y entre ellos de nuevo el de Manolo Serrano, demostraron que esta respuesta de senescencia celular se podía verificar dentro de los tumores en modelos experimentales de cáncer usando ratones, así como en muestras humanas de pacientes de cáncer. Lo que en aquel momento quedó claro es que esta respuesta existe y se da en los inicios de procesos tumorales. Gracias (en parte) a ella, estamos protegidos del cáncer y nuestras células se aseguran que en caso de sufrir algún daño genético que active un oncogén, la desatada actividad frenética de ese oncogén activo se verá contrarrestada con la parada impuesta por la maquinaria de senescencia celular. Algunos investigadores han propuesto que activar esta respuesta dentro de los tumores mediante nuevos fármacos podría ser una estrategia efectiva en el control del cáncer. Estaríamos hablando de zombificar a las células tumorales para impedir su avance, como vía alternativa o complementaria a la de inducir su muerte. Sin embargo, existen dudas sobre la conveniencia de utilizar esta medida, puesto que siempre estaríamos expuestos a la llegada de una potencial señal “resucitadora” que invitase a la célula tumoral a levantarse y andar.

¿Cómo de frecuente es la respuesta de senescencia celular? ¿Podemos verla? En un ejemplo muy gráfico, el investigador holandés Daniel Peeper del NKI de Amsterdam, demostró que los nevus de la piel, esos lunares que todos conocemos y que se van acumulando con el paso de los años, son el resultado de mutaciones potencialmente cancerosas producidas en unas células especializadas de la piel, los melanocitos encargados de producir la melanina que nos protege de los rayos ultravioleta (y nos pone morenos). Estos melanocitos en los que se ha producido una activación oncogénica se dividen inicialmente hasta formar un pequeño grupo de células de color pardo negruzco (que forman el nevus o lunar) hasta que las células imponen la senescencia celular y consiguen frenar el avance de la proliferación que podría culminar en un tumor. De hecho, una lesión similar en la que la senescencia celular no actúa controlando la división es lo que constituye un terrible y mortífero tipo de cáncer, el melanoma.

Quizás ahora, cuando observes al espejo tu piel al desnudo y te encuentres con todos estos nevus, suspires de agradecimiento a la senescencia celular.

"culo-o-codo" con nevus — «culo-o-codo» con nevus

Referencias recomendadas:

The serial cultivation of human diploid cell strains. Hayflick L, Moorhead PS. Exp Cell Res. 1961 Dec;25:585-621.

Cellular senescence in cancer and aging. Collado M, Blasco MA, Serrano M. Cell. 2007 Jul 27;130(2):223-33.

Senescence in tumours: evidence from mice and humans. Collado M, Serrano M. Nat Rev Cancer. 2010 Jan;10(1):51-7.

NOTA: Esta entrada apareció originalmente en el blog Naukas (naukas.com)

El Zoo de Matusalén (III): ¿Qué podemos aprender de la naturaleza?

Celegans-Dmelanogaster-Mmusculus — El gusano (Caenorhabditis elegans), la mosca (Drosophila melanogaster) y el ratón (Mus musculus), de izquierda a derecha, obviamente

Prácticamente todo el conocimiento que poseemos sobre los mecanismos básicos que regulan el envejecimiento se ha obtenido mediante la manipulación experimental de animales de laboratorio. Las especies que a tal efecto se han empleado tradicionalmente han sido fundamentalmente la mosca (Drosophila melanogaster), el gusano (Caenorhabditis elegans) y el ratón (Mus musculus), todos ellos pertenecientes a especies animales notoriamente malas a la hora de combatir el proceso de envejecimiento. Sin duda todo este conocimiento es de gran interés, pero no tenemos ninguna garantía de que los procesos identificados en especies con escasa longevidad y, más aún, las intervenciones antienvejecimiento que funcionen en ellos, puedan tener una traslación inmediata al envejecimiento humano.

Decíamos en las dos entradas previas que existen unos cuantos mamíferos que muestran una longevidad extrema en la naturaleza. Además de ser una curiosidad zoológica, estas especies representan probablemente excelentes ejemplos de éxito antienvejecimiento. Parece razonable pues, intentar examinar en ellos dos de los mecanismos o hipótesis que han sido propuestos hasta la fecha como base del envejecimiento para ver qué tal resisten el análisis. Quizás de este modo podamos comenzar a discernir mecanismos realmente relevantes y universales, de aquellos que puedan representar meras anécdotas o casos particulares (o ser simplemente erróneos).

La Teoría del Estrés Oxidativo

DNA-damage — El daño en el ADN está considerado una de las consecuencias del estrés oxidativo

Según esta teoría, envejecemos porque “nos oxidamos”, sin duda una hipótesis intuitivamente razonable y acorde con la experiencia propia de todos. Deriva además de la muy aceptada idea de que la “velocidad vital” está directamente relacionada con el proceso de envejecimiento. Cuanto “más rápido” vivimos, más energía quemamos, más estrés oxidativo generamos y antes envejecemos. Durante muchos años estos conceptos han estado fuertemente arraigados en la mentalidad de la sociedad y, sin excepción, en la mente de muchos científicos. Sin embargo, un largo y penoso camino lleno de fracasos experimentales y evidencias empíricas contradictorias con estas ideas ha llevado a gran parte de la comunidad biomédica a algo más que poner en duda la validez generalizada de este concepto.

No es que no existan algunas evidencias que apunten a la veracidad de esta teoría. Por ejemplo, el daño oxidativo se incrementa en los tejidos con la edad en muchas especies animales de laboratorio. También es cierto que algunas intervenciones experimentales antienvejecimiento (en particular la restricción calórica) reducen tanto las especies reactivas de oxígeno (ROS), como el daño oxidativo en los tejidos. Además, algunas manipulaciones genéticas que resultan en la prolongación de la longevidad de animales modelo, reducen a su vez el daño oxidativo en tejidos. Incluso esta perspectiva de zoología comparada ofrece algún dato en apoyo de la teoría oxidativa del envejecimiento, porque existen algunos trabajos mostrando que especies de elevada longevidad producen menores niveles de ROS.

Sin embargo, no es menos cierto que, como decimos, existe todo un cuerpo de evidencias experimentales inconsistentes con la teoría del estrés oxidativo como origen del envejecimiento. Por ejemplo, la administración de antioxidantes a animales de experimentación no resulta de manera reproducible en un beneficio para la longevidad. Más aún, la manipulación genética dirigida a aumentar las defensas antioxidantes celulares no produce una modulación del envejecimiento. Incluso al contrario, existen trabajos mostrando cómo una disminución en las defensas antioxidantes lleva a un ligero aumento de la longevidad, un resultado contrario al postulado por esta teoría.

Usando la perspectiva comparativa que nos ofrecen los animales de longevidad extraordinaria, podemos observar cómo, por ejemplo, algunos tipos de periquitos (con una longevidad máxima de 21 años) muestran un mayor daño oxidativo en su ADN que los ratones de laboratorio, de vida corta. Del mismo modo, ejemplares de rata-topo desnuda jóvenes poseen mayores niveles de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos oxidados en varios tejidos, que ratones jóvenes, pese a que la diferencia en longevidad entre ambos es de cerca de 10 veces a favor de la rata-topo.

Tampoco es que podamos afirmar que en todos los casos la relación entre nivel oxidativo y longevidad sea la contraria a la propuesta por la teoría del estrés oxidativo, pero sin duda no existe un patrón consistente y nítido que permita afirmar con rotundidad la validez de dicha teoría.

La senescencia celular

Desde los años ´60 del siglo pasado, casi 5 décadas ya, cuando Len Hayflick describió por primera vez el proceso de senescencia celular en células humanas somáticas normales (y posteriormente para un buen número de células de otras especies), la relación de este proceso celular con la biología del envejecimiento ha permanecido como objeto de debate en la comunidad científica. Recordemos que el proceso de senescencia celular consiste en la incapacidad de reiniciar la división celular una vez alcanzado un cierto número, más o menos definido, de divisiones celulares. Se postula además que surgió evolutivamente como mecanismo eficaz frente al desarrollo tumoral. Para mayor detalle recomendamos entradas anteriores de este mismo blog, como El «envejecimiento» celular – senescencia celular y Senescencia celular y cáncer. Para algunos científicos, este proceso es totalmente irrelevante en el envejecimiento mientras que para otros, es un reflejo a nivel celular del envejecimiento del organismo, e incluso algunos llegan más allá definiéndolo como el proceso clave que dicta el envejecimiento.

Una de las demostraciones más poderosas de la relación entre el proceso de senescencia celular y el envejecimiento de un organismo se produjo en un estudio del año 1981 en el que se examinó la capacidad replicativa (el número de divisiones celulares) de células puestas en cultivo y procedentes de organismos de especies con distinta longevidad. El resultado era clarísimo; cuanto más longeva la especie de la que provenían las células, mayor número de divisiones celulares eran capaces de desarrollar en cultivo. Pero quizás la interpretación del resultado sea errónea.

El cálculo del número de divisiones celulares de un cultivo celular se expresa con un parámetro denominado “nivel de duplicación de la población” (o population doubling level, PDL), que refleja el número de veces que toda la población celular en el cultivo ha sido capaz de duplicarse (hay que tener en cuenta que la división celular produce como resultado dos células hijas por cada célula que se divide). Cuando se calculan las PDLs producidas por las células de mamíferos de distinta longevidad y se representan frente a sus respectivos periodos de vida se observa una fuerte correlación positiva entre ambos parámetros.

Un factor que claramente puede hacer más confuso el análisis es el distinto tamaño de las diferentes especies empleadas en el mencionado estudio, puesto que las especies seleccionadas no sólo diferían significativamente en longevidad, si no también en tamaño, desde el caballo hasta el ratón. Puesto que todos los mamíferos necesitan proliferar desde una única célula inicial (el oocito fecundado) hasta alcanzar el tamaño adulto definitivo, parece razonable esperar que la capacidad replicativa de un organismo esté relacionada con el tamaño del organismo. De hecho, cuando se reanalizan los datos de ese estudio y se relacionan PDLs y tamaño, se encuentra también una relación significativa entre ambos parámetros.

Para tratar de resolver cuál de los dos parámetros, longevidad o tamaño, se relacionan más estrechamente con las PDLs del cultivo celular, un estudio más reciente del 2005 repitió el mismo tipo de análisis experimental con un único tipo celular obtenido a partir de 11 especies de mamíferos cuidadosamente seleccionadas. Se prestó especial atención a incluir un amplio rango de animales que se diferenciasen substancialmente tanto en su longevidad como en su tamaño y que estuviesen representados animales de gran tamaño y escasa longevidad (como la vaca) así como otros de gran longevidad y pequeño tamaño (como la rata-topo desnuda).

Plot-PDLsvsMasa — Gráfica de la relación entre capacidad replicativa (PDLs) y tamaño corporal (masa en gramos). Modificado de Lorenzini et al, Mech Aging Dev, 2005

Con esta selección de especies, el análisis resultó en una enorme correlación positiva entre capacidad replicativa (PDLs) y tamaño del animal, mientras que la correlación con longevidad fue únicamente marginal. Refinando aún más los datos mediante análisis de correlación parcial para eliminar la contribución del tamaño, la pobre relación entre capacidad replicativa y longevidad desaparece por completo, mientras que al contrario, controlando la contribución del efecto de la longevidad mediante el mismo tipo de análisis estadístico sigue resultando en una potente correlación entre capacidad replicativa y tamaño. Por tanto, podemos concluir que el principal factor que dicta la capacidad replicativa celular es el tamaño del organismo y no su longevidad.

Como colofón a esta entrada del Zoo de Matusalén que discurre a través de lo que en una primera aproximación podríamos considerar una rareza zoológica, animales de longevidad extrema, podríamos subrayar la enorme utilidad que aporta el estudio comparado de los miembros de estas especies al conocimiento sobre un proceso tan elemental y consustancial a la vida como es el envejecimiento. Por supuesto el estudio de animales de longevidad extrema no es excluyente del uso de las especies animales que tradicionalmente se han empleado en el laboratorio. Existen numerosas y evidentes razones para seguir utilizando dichos organismos modelo, pero sin duda la comparación con estas otras especies de longevidad extrema nos ofrece una perspectiva interesantísima que no ha de perderse de vista.

Resulta por el contrario llamativo la escasísima información que poseemos acerca del envejecimiento en un entorno natural, con datos fundamentales de longevidad desconocidos para la mayoría de las especies. Si bien es cierto que el envejecimiento es un proceso escasamente presente en la naturaleza, en donde los individuos necesitan estar en plena facultad para poder sobrevivir y el medio ejerce una presión selectiva que elimina a aquellos que comiencen a desarrollar signos de envejecimiento, la observación del proceso de envejecimiento en el medio natural nos puede ofrecer una visión relevante sobre las causas y las características del mismo que en muchas ocasiones podemos tener distorsionada debido a las características peculiares del reducido número de especies modelo empleadas en investigación. De lo contrario, un día podríamos encontrarnos en una situación análoga a la que se encontró el destacado investigador del cáncer y premio Príncipe de Asturias Judah Folkman, y tendríamos que contestar a preguntas de un periodista, cuando nos interrogue si las investigaciones han conseguido derrotar al envejecimiento: “tenemos excelentes noticias, si usted es un ratón podemos retrasar su envejecimiento”.

Induciendo el “envejecimiento” de los tumores

Un artículo científico publicado en el último número de la revista Cancer Cell por el grupo que dirige Mariano Barbacid, del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), ofrece un excelente ejemplo de una de las nuevas vías terapéuticas que recientemente se han abierto en el tratamiento del cáncer, explotando el proceso de senescencia celular.

La estrategia consiste en inducir la senescencia celular de las células tumorales, consiguiendo así frenar de manera irreversible su proliferación. En una entrada anterior de este mismo blog tuvimos ocasión de explicar cuál es la función anti-tumoral del proceso de senescencia tumoral (ver “La senescencia celular nos protege frente al cáncer”). Desde su descripción como un proceso fisiológico de defensa natural frente a los inicios tumorales en el año 2005 (en cuatro artículos aparecidos en la revista Nature), la posibilidad de manipular esta vía como estrategia frente al crecimiento tumoral ha estado presente en la mente de muchos grupos de investigación.

invivo-senescence — Tinción de senescencia (azul) en tumor benigno de pulmón

Diversos laboratorios demostraron ya anteriormente que atacar el oncogén que dirige el proceso tumoral puede resultar efectivo induciendo senescencia celular. De modo similar, reactivando genes supresores de tumores (genes que median mecanismos de defensa anti-tumoral y que frecuentemente se encuentran silenciados o eliminados en tumores) se observó la efectividad de la senescencia celular controlando la progresión tumoral.

Una tercera vía, que también ha comenzado a ser explorada, consiste en lo que se denomina “letalidad sintética”. Eliminar una actividad que no es la iniciadora del proceso tumoral, pero de la cual depende de manera crítica la célula tumoral para su proliferación o supervivencia. Idealmente además, esta actividad debería ser selectivamente imprescindible para el crecimiento tumoral y no para el de la célula normal sana.

raton albino — La investigación se ha realizado en modelos de ratón

El grupo de Mariano Barbacid trabaja de manera histórica con la familia de oncogenes Ras, habiendo sido el descubridor del primer oncogén humano, H-Ras, en 1982. A su regreso a España para dirigir el CNIO, inició proyectos de investigación que pretendían recrear en modelos animales el proceso de inducción oncogénica que se da en los pacientes de cáncer tras la activación de oncogenes. Uno de dichos modelos es el ratón knockin (ratón al que se le sustituye el locus endógeno por uno modificado) que expresa una variante oncogénica de K-Ras, un oncogén que se encuentra mutado en el 25% de los adenocarcinomas de pulmón humano. Los ratones knockin de K-Ras desarrollan también tumores de pulmón y representan una oportunidad perfecta para estudiar en mayor detalle el proceso tumoral y ensayar posibles vías terapéuticas.

Una de estas estrategias de intervención terapéutica consistió en estudiar la dependencia de los tumores originados por la mutación de K-Ras, de la actividad enzimática de CDK4, una kinasa implicada en el avance del ciclo celular y, por tanto, de la proliferación. Para ello, el grupo de Barbacid cruzó estos ratones con activación de K-Ras con otros generados previamente en su laboratorio y en los que se puede inducir la eliminación específica del gen que codifica CDK4. La falta de CDK4 tiene efectos moderados. La descripción que de ellos realizó previamente el grupo de Barbacid había identificado únicamente un defecto en la producción de insulina por parte de las células beta del páncreas y esterilidad de las hembras.

pulmones-KRas — Seguimiento por imagen molecular de los pulmones de los ratones

Cuando se activa K-Ras oncogénico y simultáneamente se elimina CDK4, los investigadores observaron cómo las células que portan la mutación oncogénica permanecen paradas, sin proliferar, y por tanto no dan lugar a tumores. Las células permanecen en ese estado, como congeladas, durante todo el tiempo que fueron seguidas, lo que llevó a los investigadores a plantearse la posibilidad de que se estuviese induciendo el proceso de senescencia celular, caracterizado precisamente por esa parada proliferativa irreversible. Cuando se examinaron con detalle los pulmones de estos animales, se pudo comprobar que, efectivamente, la activación de K-Ras con eliminación simultánea de CDK4 conduce a senescencia celular de manera inmediata.

Cabe destacar que la eliminación de CDK4 no causa ningún problema en las células normales del pulmón, lo cual representa, como decíamos al inicio, un excelente ejemplo de “letalidad sintética”, aprovechando la dependencia de la célula tumoral de una actividad enzimática para atacar al tumor sin dañar a las células sanas.

Los mismos principios fueron también validados empleando líneas celulares en cultivo derivadas de adenocarcinomas de pulmón humanos que portan mutaciones activadoras en el oncogén K-Ras, demostrando la relevancia de las observaciones en ratón. Más aún, empleando un inhibidor sintético específico de CDK4 y desarrollado por la empresa farmacéutica Pfizer, se consiguieron resultados similares, aunque no tan espectaculares como los observados en ratón, algo no sorprendente si tenemos en cuenta la potencia de la manipulación genética frente al efecto de un fármaco.

Imagen del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO)

No obstante cabe resaltar la sensata prudencia del Dr Barbacid frente a la habitual ligereza con que se trata la información científica en la prensa, cuando deja claro que «estos resultados representan tan solo una indicación de un fenómeno biológico no predecible con los conocimientos existentes, pero en ningún momento garantiza que estas observaciones puedan ser reproducidas en pacientes con adenocarcinoma de pulmón por muy sofisticado que sean los modelos murinos en los que se han llevado a cabo estas investigaciones«. No obstante, en colaboración con el Dr Manuel Hidalgo, jefe de la unidad de Investigación Clínica del mismo centro, se iniciarán próximamente ensayos clínicos con pacientes para evaluar la eficacia de esta estrategia de inhibición de CDK4 en tumores de pulmón con mutación en K-Ras.

Para terminar, habría que resaltar dos aspectos importantes derivados de esta investigación. El primero, más específico, sería la efectividad en el tratamiento anti-tumoral de la inducción de senescencia celular. Este tipo de resultados son prometedores puesto que aportan toda una nueva vía de exploración de potenciales tratamientos anti-tumorales, distintos a los ya clásicos, más destinados a inducir la muerte de la célula tumoral. El segundo, más general, nos habla de la importancia de la investigación básica, como método eficaz para identificar procesos que se puedan demostrar posteriormente como relevantes en la aplicación clínica. Sin modelos animales experimentales no podríamos llegar a revelar la importancia de la “letalidad sintética” entre K-Ras oncogénico y CDK4.

Artículo original:

Puyol M, Martín A, Dubus P, Mulero F, Pizcueta P, Khan G, Guerra C, Santamaría D, & Barbacid M (2010). A synthetic lethal interaction between K-Ras oncogenes and Cdk4 unveils a therapeutic strategy for non-small cell lung carcinoma. Cancer cell, 18 (1), 63-73 PMID: 20609353

Mejor artículo del 2009 en Aging Cell para un trabajo español

La revista Aging Cell, publicación de la Sociedad Anatómica de Gran Bretaña e Irlanda, elige cada año (este es sólo el segundo año que lo hacen) de entre todos los artículos publicados en su revista, cuál es considerado por su panel editorial el mejor artículo del año. Pese a contar aún con pocos años a sus espaldas, Aging Cell es ya una de las revistas de mayor reputación en el área de la investigación en biología del envejecimiento (factor de impacto 2008 = 7,8; número 1 de las publicaciones del área de Geriatría y Gerontología),

Este año, el artículo seleccionado es:

“Anti-aging activity of the Ink4/Arf locus”. Ander Matheu, Antonio Maraver, Manuel Collado, Isabel Garcia-Cao, Marta Cañamero, Consuelo Borras, Juana María Flores, Peter Klatt, José Viña, y Manuel Serrano. Aging Cell. 2009 Apr;8(2):152-61. (PMID: 19239418)

El trabajo fue realizado por el grupo que dirige Manuel Serrano en el Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), en Madrid. Es continuación de un trabajo previo que describía la generación de ratones modificados genéticamente, que portan un gran fragmento genómico de ADN (utilizando cromosomas artificiales bacterianos, BACs) en el que se localiza una copia entera del locus Ink4/Arf incluidas sus secuencias reguladoras, y que fue publicado en la revista Genes and Development en el año 2004 (este artículo está accesible gratis aquí).

Este locus Ink4/Arf es una región del genoma muy interesante, pues codifica dos productos distintos a partir de la misma región de ADN, en un ejemplo de economía génica más propio de organismos evolutivamente mucho más sencillos. Además, las proteínas que codifica tienen funciones supresoras de tumores esenciales, como atestigua el hecho de que este locus se encuentre muy frecuentemente silenciado, mutado o delecionado por completo, en un enorme porcentaje de tumores humanos. Ink4 resulta en la producción de la proteína p16, que es un inhibidor del ciclo celular (un freno a la división celular), mientras Arf codifica la proteína p14Arf (en ratones conocida como p19Arf) que es un activador de p53, el gen estrella de la biología molecular, esencial en la custodia de la integridad del genoma.

Arf_locus — Organización del locus Ink4/Arf

Pero, a parte de su más que reconocido papel antitumoral, estas proteínas p16 y Arf han sido señaladas por muchos como responsables del envejecimiento celular. Siendo concisos, ambas están involucradas en la maquinaria que establece la senescencia celular, el cese irreversible en la capacidad proliferativa de las células cuando se alcanza un cierto número de divisiones celulares conocido como el límite de Hayflick (ver entrada de este mismo blog sobre senescencia celular para más detalles). Para muchos, el acúmulo de células senescentes en los tejidos está detrás del envejecimiento del organismo, y los niveles de ambas proteínas (especialmente de p16) aumentan paulatinamente con la edad. Esto sin duda les hace unos buenos biomarcadores de envejecimiento, pero su papel como inductores del proceso es algo menos claro.

En los últimos años se han descrito además SNPs (polimorfismos de nucleótido simple que generan variaciones en cada una de las características que determinan los genes) asociadas a enfermedades relacionadas con el envejecimiento en este locus o próximas a él. La idea sería que ligeras variaciones en la secuencia de este locus están asociadas a un mayor o menor riesgo de padecer ciertas enfermedades que están ligadas al envejecimiento.

Existen también artículos de gran relevancia que apuntan a una menor capacidad de regeneración de tejidos durante el envejecimiento debido a ese acúmulo de p16 y/o Arf en las células.

Por todo ello (y muchos más datos que por tiempo y espacio no vamos a detallar ahora), en la mente de muchos científicos se estableció el concepto de que evolutivamente llegamos a un trato por el cual estamos más protegidos frente al cáncer durante nuestra juventud, antes del periodo reproductivo, gracias a la acción de estos genes supresores de tumores (como el locus Ink4/Arf, pero también para el caso de p53) que por el contrario nos producen envejecimiento más adelante. Usando un término complejo, que siempre viste mucho más, favorito de Judy Campisi, es lo que se conoce por antagonismo pleiotrópico.

Sin embargo, lo que Ander Matheu y el resto de colaboradores observó cuando generaron este ratón que tiene dosis génica extra de Ink4/Arf es que los ratones están mucho más protegidos frente al cáncer (buena noticia, es posible aumentar nuestras defensas naturales antitumorales) y además, viven más y mejor. No sólo aumentó la vida media de la colonia de ratones que portaban una copia extra del gen, si no que además diversos marcadores asociados al envejecimiento, como son la coordinación motora, el crecimiento de pelo, o la acumulación de daño en el ADN, eran mejores en estos ratones. Si prescindimos de los animales que murieron de cáncer para elaborar la curva de supervivencia, aún se observa una vida media más prolongada en los ratones con copia extra de Ink4/Arf, lo que permite diferenciar el efecto antitumoral del efecto antienvejecimiento. Y si aumentamos el número de copias transgénicas a dos (un total de cuatro copias de Ink4/Arf, dos naturales y dos extra), los resultados son aún más claros y potentes.

Eso sí, con cuatro copias de Ink4/Arf la cosa ya no es tan positiva, al menos para «ellos». Los ratones macho doble transgénicos son estériles y tienen una clara atrofia testicular. Analizando los túbulos seminíferos de estos animales se pudo observar que estaban prácticamente vacíos, sin espermatogonias (las células madre que darán lugar a los espermatozoides) y únicamente contenían células de Sertoli.

Los telómeros y la senescencia celular

En una entrada anterior, veíamos cómo se llegó al descubrimiento de la estructura molecular de los telómeros, fundamentalmente por Liz Blackburn cuando trabajaba en el laboratorio de John Gall.

Ya en 1984, en el laboratorio que dirigía Elizabeth Blackburn en la Universidad de California en Berkeley, Carol Greider, entonces estudiante de doctorado recién llegada al laboratorio en Abril de ese año, acometió el excitante proyecto que le encargó Liz Blackburn de identificar y aislar la enzima responsable de añadir esas repeticiones en los extremos de los cromosomas. El día de Navidad de ese mismo año Carol Greider obtuvo los primeros resultados positivos en la identificación y aislamiento de esta actividad. En Diciembre del año siguiente, 1985, aparecía publicado en la revista Cell la descripción de esta enzima, que denominaron transferasa terminal del telómero, y que inmediatamente pasó a ser conocida como telomerasa. Esta enzima es una polimerasa particular, puesto que posee un componente proteico, en donde reside la actividad polimerasa, y un componente de ARN que sirve de molde a la enzima para sintetizar esas repeticiones características del telómero. La telomerasa es la enzima responable de la integridad del telómero de organismos simples como Tetrahymena y la levadura, ya permite su división celular continua sin pérdida de secuencias teloméricas. En las células de la línea germinal, que como vimos anteriormente pueden ser consideradas células inmortales, también existe actividad telomerasa detectable que garantiza la integridad de los telómeros en los cromosomas inmortales que viajarán de generación en generación a lo largo de la evolución. Sin embargo, las células somáticas que se derivan de las germinales carecen de actividad detectable telomerasa lo que supone que sus telómeros deberían estar expuestos a los efectos del problema de la replicación terminal. De hecho así es, y cuando se compara la longitud telomérica de células de la línea germinal y de células somáticas de un mismo individuo, estas últimas presentan telómeros más cortos debido a la incapacidad para reponer las secuencias que se van perdiendo de división en división celular.

: Calvin Harley

En 1990, una vez que Carol Greider había conseguido una posición independiente en los laboratorios de Cold Spring Harbor en Nueva York, comenzó a colaborar con Calvin Harley de la Universidad McMaster en Ontario, Canada. Harley tenía un gran interés en definir cómo se producía el control del número de divisiones celulares y en identificar el reloj biológico que marca a la célula el momento de cesar en su capacidad de proliferación. La unión del conocimiento de Calvin Harley y la experiencia en el campo de los telómeros de Carol Greider fructificó en la descripción del acortamiento telomérico debido a las sucesivas rondas de división celular, conectando así la senescencia celular descrita por Hayflick con los telómeros como mecanismo molecular capaz de detectar el número de divisiones celulares. Más aún, cuando se examinaron los telómeros de células de la piel de donantes jóvenes y viejos, se observó una perfecta correlación entre la longitud de los mismos y la edad del individuo de procedencia, estableciendo el acortamiento telomérico como un fenómeno natural asociado al envejecimiento más allá de la observación hecha en células en cultivo. Tras esta productiva colaboración con Carol Greider, Calvin Harley decidió dejar el mundo académico de la ciencia y pasarse al lado comercial y por ello, en 1993, entró a formar parte de la recién creada compañía de biotecnología Geron de Menlo Park en California (de donde se ha retirado como CEO en Septiembre del año 2009), cuyo principal interés está centrado en desarrollar estrategias de prolongación de la vida fundamentalmente basadas en manipular la actividad telomerasa y mantener nuestros telómeros largos. Este acercamiento al mundo de la ciencia empresarial de Harley terminó por distanciar a ambos, debido a la incomodidad que sentía Carol Greider estando en el foco de la atención pública, foco atraído la mayoría de las veces por pronunciamientos un tanto exagerados de su compañero para reforzar la posición en el mercado de su compañía.

Recurriendo de nuevo al símil de los cordones de los zapatos, las sucesivas divisiones celulares, debido al problema de la replicación terminal de Olovnikov ya enunciado antes, van erosionando los telómeros durante el envejecimiento del mismo modo que el uso va desgastando la protección de plástico que rodea el final de cada cordón. Llegado un punto en el que se pierde esa capacidad protectora, los cordones quedan expuestos y se deshilachan.

¿Qué son los telómeros?

Los estudios pioneros de Hermann Müller (premio Nobel en 1945) trabajando con la mosca del vinagre, Drosophila melanogaster, y de Barbara McClintock (también premio Nobel en 1983) estudiando el maíz, Zea mays, habían concluído que los extremos de los cromosomas poseen unas estructuras especiales denominadas telómeros (del griego telos: final y meros: parte). Estas estructuras representarían una protección fundamental para que los cromosomas no resulten fusionados por la maquinaria de reparación de la célula ya que permiten distinguir estos extremos de cualquier otra rotura en el ADN celular que debe ser reparada y vuelta a fusionar. En muchas ocasiones se ha empleado el símil de los extremos de los cordones de los zapatos para referirse a la función de los telómeros que estarían, al igual que las fundas plásticas que se usan para proteger el extremo de los cordones, protegiendo la integridad de los cromosomas.

telomeros — Telómeros (en amarillo) en los extremos de los cromosomas (en azul). Cortesía: Martina Stagno

Para poder entender el papel de los telómeros y de la enzima telomerasa en el envejecimiento hay que repasar las nociones básicas de replicación del ADN, el material genético que contiene toda la información necesaria para la vida. En 1953, James Watson y Francis Crick, que junto a Maurice Wilkins recibieron el premio Nobel en el año 1962, habían descrito la estructura de doble hélice del ADN en una publicación histórica (y sorprendentemente corta de 1 página que se puede leer aquí) en la revista Nature. El modelo de estructura del ADN establece que dos cadenas de nucleótidos se enfrentan de manera complementaria (timina con adenina y guanina con citosina) y se retuercen a modo de hélice que gira hacia la derecha. Por tanto, tenemos dos hebras que discurren en paralelo y que son copia complementaria la una de la otra. Cuando una célula se dispone a dividirse en dos células hijas inicia el proceso de replicación del ADN con el objetivo de fabricar una copia fiel de cada una de las hebras. De esta delicada función celular se encarga la enzima ADN polimerasa. Debido a la extraordinaria longitud del ADN y a que el proceso de replicación debe realizarse en un tiempo razonable, el trabajo es realizado por varias moléculas de ADN polimerasa al mismo tiempo, cada una de ellas encargada de una región de la hebra.

replicacion — Replicación del ADN. La síntesis de la cadena retrasada se realiza en fragmentos a partir de "cebadores" que posteriormente se eliminan.

El primer paso de la replicación es la separación de las dos hebras de manera que su interior sea accesible a la polimerasa. La actividad de la enzima le permite leer el nucleótido a copiar a partir de la cadena original que actúa como molde, seleccionarlo e incorporarlo a la cadena hija. Sin embargo, la ADN polimerasa sólo es capaz de funcionar en una dirección (un argumento más en contra de los defensores del diseño «inteligente«), por lo que una de las cadenas se sintetiza de manera continua según se va abriendo la doble hélice, mientras que la otra depende de la actividad de la síntesis de una pequeña cadena de ARN que sirva de “cebador” a partir del cual añadir los nuevos nucleótidos. Posteriormente estas cadenas “cebadoras” son eliminadas y sustituidas por nucleótidos de ADN. Este proceso es posible a lo largo de la longitud de toda la hebra de ADN, a excepción de los extremos, puesto que cuando el último cebador sea eliminado, la ADN polimerasa no será capaz de rellenar ese hueco debido a su incapacidad de funcionar en los dos sentidos. De manera que nos encontramos con un proceso de copia del ADN, la molécula esencial para la célula que contiene toda la información, que producirá dos nuevas moléculas formadas por una cadena parental y una hija, que va dejando de copiar un pequeño fragmento en el extremo en cada ronda de replicación. Sin duda no parece un proceso demasiado eficiente, puesto que tras varias divisiones celulares, las células hijas estarán recibiendo moléculas de ADN más cortas de lo original.

James Watson, en el año 1972, mientras se encontraba preparando una clase de bioquímica en la universidad de Harvard, reflexionó sobre este problema al darse cuenta de que un tipo de virus que infecta a bacterias denominado bacteriófago T7, une de manera consecutiva varias moléculas de ADN antes de iniciar su replicación para, de esta manera, minimizar la pérdida de secuencias que supone el problema de replicación de los extremos. Al mismo tiempo, y muy lejos de allí, Alexei Olovnikov en el Instituto Gamelaya de la entonces República Soviética, se encontraba también reflexionando sobre las particularidades del ADN y el proceso de replicación mientras esperaba el tren. Se dio cuenta entonces que si la máquina del tren es la ADN polimerasa que avanza sobre las vías del ADN, el trozo de vía sobre el que descansa la máquina al iniciar su marcha no puede ser replicado.

watson-olovniokov — James Watson (izq) y Alexei Olovniokov (der)

El problema de la replicación final de Watson y el problema de la replicación inicial de Olovnikov confluyen en la idea de que cada división celular conlleva una pérdida de secuencias del ADN que, sin duda, no es aceptable para la integridad de la información genética contenida en el ADN. Olovnikov conocía los trabajos de Len Hayflick describiendo el proceso de senescencia celular y esto le llevó a publicar un artículo teórico en el año 1973 en el que proponía que este acortamiento de las hebras de ADN en cada ronda de replicación y división celular podía ser la base del proceso descrito por Hayflick. De alguna manera, teorizaba Olovnikov, la célula “siente” esa pérdida de ADN como algo incompatible con la supervivencia celular.

Sin embargo, esto no es del todo exacto, puesto que los extremos de los cromosomas en los que se organizan las hebras de ADN se encuentran protegidos para evitar esas pérdidas de secuencias que no podrían ser asumibles. En el año 1978, Elizabeth H. Blackburn, trabajando en el laboratorio de John Gall en Yale, describió que los extremos del único cromosoma lineal del protozoo ciliado Tetrahymena, están formados de secuencias simples repetidas. Además pronto fue evidente que lo mismo ocurría en muchos otros organismos que fueron examinados y la comparación de las secuencias identificadas en todos ellos mostró un alto grado de similitud entre organismos muy diversos, por lo que este fenómeno debía de representar un mecanismo conservado en la evolución para mantener intactos estos extremos. De hecho, un experimento clave para demostrar que estas secuencias están conservadas y son capaces de funcionar incluso en distintas especies fue el realizado por Jack W. Szostak de la Harvard Medical School, usando las secuencias identificadas por Liz Blackburn. Zsostak estaba intentando generar cromosomas artificiales de levadura (YACs) y todos sus intentos fracasaban porque sus YACs eran inestables. Cuando añadió las secuencias repetidas de telómero derivadas de Tetrahymena, sus YACs funcionaron. Además, tras un periodo dentro de la levadura, estos YACs poseían telómeros aún más largos, lo que implicaba que debía existir una actividad enzimática capaz de añadir más secuencias repetidas a los telómeros, alargándolos. Esta actividad enzimática sería más tarde identificada y aislada, y se conoce por el nombre de telomerasa. En su descubrimiento tuvo un papel fundamental Carol W. Greider; pero esta historia formará parte de otra entrada de este blog.

Recientemente, en el año 2009, Elizabeth H. Blackburn, Jack W. Szostak y Carol W. Greider fueron galardonados con el premio Nobel por su descripción molecular de los telómeros y la identificación de la telomerasa, lo que ha permitido el entendimiento de la maquinaria molecular encargada de preservar la integridad de los extremos de los cromosomas y ha dibujado un modelo que nos permite entender el papel que estas estructuras juegan en la resolución del problema de la replicación terminal. Todos estos descubrimientos tienen enorme relevancia en nuestra visión del proceso de envejecimiento a nivel molecular, así como en la biología del cáncer, como veremos en otro momento.

La senescencia celular nos protege frente al cáncer

Pese a que en la descripción original de la senescencia celular Hayflick apuntó a su posible conexión con el fenómeno de envejecimiento celular, reflejo a pequeña escala de lo que ocurre con un organismo entero tras el paso del tiempo, posteriormente otras investigaciones pusieron de manifiesto una explicación alternativa a lo observado. En concreto, en el año 1997, en los laboratorios de Cold Spring Harbor en el estado de Nueva York, Manuel Serrano, entonces investigador postdoctoral en el prestigioso laboratorio de David Beach, y en colaboración con el recientemente creado laboratorio de Scott Lowe, describieron cómo las células normales primarias tanto de humano como de ratón, respondían ante la presencia de un oncogén activado, mediante unos cambios morfológicos y una parada irreversible en su proliferación, que resultaban indistinguibles de lo descrito más de tres décadas atrás por Hayflick como senescencia celular. Por ello denominaron al proceso que acababan de observar como senescencia inducida por oncogenes, puesto que el estímulo que llevaba a las células a entrar en ese letargo característico de la senescencia celular no era la acumulación de sucesivas divisiones celulares, si no la presencia de un oncogén.

Serrano-Beach-Lowe — Izquierda-derecha: Manuel Serrano, David Beach, Scott Lowe

Inmediatamente, los autores de este artículo postularon la posibilidad de que dicha respuesta supusiera un mecanismo de defensa celular ante la exposición a lo que evidentemente resulta peligroso para la célula. Establecer de manera repentina una parada en la maquinaria de división celular ante la agresión que supone la actividad oncogénica, garantiza la imposibilidad de expansión de células dañadas que, de otra manera, se adueñarían del tejido en el que residiesen, dando lugar a un tumor. Como refuerzo de esta hipótesis, los investigadores describieron cuáles eran las moléculas fundamentales que formaban parte de este mecanismo de defensa celular, que resultaron ser moléculas clave en la defensa frente al cáncer, aquellas codificadas por genes que se conocen bajo el nombre de supresores de tumores.

Pese al inicial entusiasmo con que estas investigaciones fueron recibidas por la comunidad científica, investigaciones posteriores empezaron a poner en duda la relevancia del sistema empleado tanto por Hayflick para describir la senescencia celular, como la de Serrano y colaboradores para documentar la senescencia inducida por oncogenes. Muchos investigadores apuntaban a las condiciones artificiales y no exentas de ambientes “estresantes” para la célula como responsables de lo observado por Hayflick. A fin de cuentas, las células que residen en el organismo distan mucho de estar sometidas a medios de cultivo ricos en factores de crecimiento, están expuestas a concentraciones de oxígeno muy inferiores a las utilizadas en los incubadores presentes en las salas de cultivo celular, y sus “anclajes” no se parecen en nada al plástico de las placas a las que se adhieren y sobre las que crecen las células en el laboratorio. En particular, con respecto a la relevancia de la senescencia inducida por oncogenes, muchos investigadores empezaron a mostrar sus dudas, fundamentalmente porque un proceso observado únicamente en semejantes condiciones tan artificiales difícilmente resulta creíble. Comenzaron además a describirse modelos animales de desarrollo de cáncer utilizando ratones modificados genéticamente de manera que expresaran oncogenes activados, con el objetivo de recrear en el ratón el inicio tumoral provocado por mutación genética de oncogenes. La conclusión para muchos era que bastaba con la expresión de un oncogén activado para que se iniciase un proceso de crecimiento tumoral, sin lugar por tanto para lo observado en cultivo por Serrano y colaboradores.

Puestas así las cosas, para muchos la senescencia celular apareció como un artefacto. Eso sí, como recuerdo oír decir con ironía a Manuel Serrano, sin duda un artefacto muy útil, porque por “casualidad” se produce en respuesta a la presencia de oncogenes, resulta tremendamente útil para proteger a las células del efecto perjudicial de la acción de los oncogenes y dentro de la maquinaria celular es llevado a cabo por genes que “casualmente” se han encontrado prácticamente en la totalidad de los tumores humanos mutados, silenciados, o totalmente ausentes («delecionados»). De hecho, las investigaciones realizadas durante aquellos años empleando el sistema celular de senescencia celular, así como el modelo de senescencia inducida por oncogenes, aportaron pistas que se revelaron posteriormente como muy útiles en la investigación frente al cáncer.

No obstante, en el año 2005, empleando muy diversas aproximaciones experimentales y en modelos tanto de ratón como en muestras humanas, cuatro grupos distintos (entre ellos el de Manuel Serrano) publicaron simultáneamente la existencia de la senescencia inducida por oncogenes en tejidos en vivo sometidos al estrés inducido por la presencia de diversos oncogenes activados. Más aún, la senescencia inducida por oncogenes se demostró como un mecanismo tremendamente efectivo en la defensa antitumoral, puesto que cuando se anula de manera experimental, por ejemplo manipulando genéticamente el ratón para impedir la expresión de alguno de estos supresores de tumores clave en la respuesta de senescencia, los animales desarrollan cáncer. Estas demostraciones supusieron un espaldarazo para la teoría del papel en la defensa frente al desarrollo del cáncer que supone el proceso de senescencia celular. Desde aquel año 2005 han sido muchos otros laboratorios los encargados de aportar pruebas adicionales de la existencia de este proceso, de su importancia como mecanismo de defensa antitumoral y de refinar nuestro conocimiento sobre la maquinaria que lo ejercita y las circunstancias que rodean el proceso.

El objetivo final, sin duda, sería entender al detalle los mecanismos íntimos del proceso natural, para intervenir sobre él con estrategias terapéuticas que nos permitan desarrollar nuevos y más efectivos medicamentos frente al cáncer.

Senescencia celular y cáncer

Describíamos en una entrada anterior, dedicada a las causas moleculares del envejecimiento, que en los años 60 Len Hayflick describió el proceso de senescencia celular; aquel por el cual todas las células somáticas de un organismo, cuando son puestas en cultivo proliferan de manera normal hasta experimentar una serie de cambios morfológicos que acompañan la parada irreversible en su capacidad de dividirse. Estas observaciones fueron pioneras y marcaron el inicio de un campo de estudio en la capacidad proliferativa limitada de las células. Pero su descripción resultó complicada. Cuando Hayflick redactó sus observaciones y mandó sus resultados a publicar a la revista Journal of Experimental Medicine, la contestación negativa que recibió vino acompañada de un comentario «nada agradable» por parte del editor encargado de examinar su trabajo, Peyton Rous, posteriormente galardonado con el premio Nobel en el año 1966 por sus pioneras observaciones sobre la transmisión de ciertos tipos de cáncer y las infecciones virales. Según Rous, el único motivo por el cual las células que Hayflick había extraído de humanos, puesto en cultivo e intentado expandir, habían cesado en su proliferación era por su incapacidad e ineptitud para cultivar células, puesto que todas las células puestas en cultivo, son esencialmente inmortales.

“El mayor hecho derivado de la investigación en cultivos celulares de los últimos 50 años es que las células, capaces de manera innata de multiplicarse, lo harán indefinidamente si se les suministra el medio adecuado para ello” Peyton Rous

Y ahí está el quid de la cuestión. Desde que Ross Harrison en el año 1907 iniciase la época del cultivo de células animales, los pioneros de esta novedosa tecnología habían tenido que desarrollar medios nutritivos en los que mantener las células y ser especialmente cuidadosos con las contaminaciones (por aquel entonces aún no se conocían los antibióticos).

Pero los primeros éxitos, como los del cirujano francés afincado en Nueva York y ganador del premio Nobel, Alexis Carrel, que consiguió establecer cultivos de células de embrión de pollo que se mantuvieron vivos durante 34 años (dos años más de los que vivió el mismo Carrel) y en especial el cultivo de la línea de células tumorales HeLa por George Gey en 1952, parecían indicar que las células extraídas de los tejidos eran esencialmente inmortales y podían ser propagadas y mantenidas indefinidamente en cultivo. Estas observaciones llevaron a la aceptación generalizada de la idea de que las células individuales del organismo son inmortales, mientras que el organismo en si es mortal. De este hecho se derivaba la hipótesis de que el envejecimiento era un fenómeno del organismo multicelular completo y no un fenómeno individual celular.

Sin embargo, posteriormente se pudo demostrar que los cultivos de Alexis Carrel no eran “reproducibles” y que para el resto de líneas celulares conocidas por aquellas fechas, las células habían perdido esta barrera o límite proliferativo y por ello, se dividían indefinidamente. Las células HeLa, que mencionábamos antes, fueron establecidas por George Gey a partir de una biopsia del cuello uterino de una paciente (sin su consentimiento, por cierto) llamada Henrietta Lacks (de ahí el nombre de la línea, Henrietta Lacks) y que posteriormente falleció de cáncer de cuello de útero. Gey observó que estas células se establecían y propagaban en cultivo sensacionalmente, lo cual permitía tener un sistema celular con el que desarrollar todo tipo de experimentos en el laboratorio. Las células HeLa tuvieron tanto éxito que hoy en día podemos afirmar sin temor a exagerar que todo laboratorio que trabaje con células humanas ha usado en algún momento, si no usa rutinariamente, esta línea celular. De hecho, se ha podido observar que una de las mayores contaminaciones en las líneas celulares que se distribuyen de laboratorio a laboratorio en el mundo, proviene de células HeLa creciendo como “invasoras” en tus cultivos celulares. Alguien calculó una vez que la expansión de células HeLa a lo largo de los años ha llegado a generar un volumen tal de células que equivaldría a 100 veces el Empire State Building de Nueva York (personalmente me parece un cálculo «arriesgado»).

Por el contrario, las líneas de fibroblastos aisladas por Hayflick procedían de fetos sanos y, por tanto, sus células son consideradas normales, diploides (mantienen su juego de cromosomas materno y paterno intacto sin duplicaciones ni pérdidas) y primarias, es decir, no han sufrido ningún tipo de alteración genética. Las células, así, son siempre “mortales” en contraposición a las células tumorales, que son aneuploides o poliploides (con pérdidas o ganancias cromosómicas o con múltiples juegos de cromosomas) y transformadas. Las células tumorales son esencialmente “inmortales«.

La fascinante historia de las células HeLa se puede conocer en mayor detalle leyendo el sensacional libro de Rebecca Skloot «The immortal life of Henrietta Lacks« que fue publicado (en inglés) recientemente y es todo un éxito de ventas.

Las células de la línea germinal son inmortales

Ya en el siglo XIX, el biólogo celular y evolucionista alemán August Weismann había postulado que los organismos multicelulares morían debido a su incapacidad para mantenerse a partir de divisiones celulares indefinidas. Este hecho lo ponía en relación con el mantenimiento de las células de la línea germinal, que perduran de generación en generación a lo largo de la vida de una especie, y que por tanto son, esencialmente, inmortales.

Las células germinales son las que dan origen al esperma y a los óvulos y son inmortales en el sentido de que, tras la fertilización, son capaces de dar lugar a todo un organismo maduro completo compuesto de células mortales (conocidas como células somáticas en contraste con la denominación de células germinales) y a más células germinales que retendrán la capacidad de volver a generar de nuevo todo un organismo completo. August Weismann a finales del siglo XIX propuso su teoría de que sólo las células que formaban parte de esta línea germinal poseían la capacidad de transmitir la información hereditaria que se pasa de generación en generación y que, por tanto, no existe ninguna característica aprendida o adquirida por las células somáticas de un organismo que pueda ser transmitida a las siguientes generaciones, algo que se conoce como “barrera de Weismann”.

La idea implícita en los trabajos de Weismann de que las células somáticas no poseen una capacidad de división continua que permita mantener a los organismos de manera indefinida, sólo pudo ser examinada y corroborada por Len Hayflick en los años 60 del siglo XX (ver entrada anterior de este blog), y no sin resistencia.